重组人MASP-2活性基因片段CCP_1-CCP_2-SP、CCP_2-SP和SP腺病毒载体的构建

【摘要】凝集素途径是感染初期就被活化的重要补体激活途径,而作为凝集素活化途径的关键酶,MASP-2是目前发现的唯一的能够直接启动补体级联反应的甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶(mannan-bindinglectinassociatedserineproteases,MASP)。近年来越来越多的研究发现：MASP-2的重组SP结构域可以有效结合并裂解C2,但要裂解C4进而启动后续的级联反应就可能需要有CCP(complementcontrolprotein)结构域的存在。为了研究MASP-2的结构和功能,得到具有C2和C4裂解活性以及可以启动后续级联反应的MASP-2活性片段,进一步研究MASP-2与感染的关系,本次实验以MASP-2的活性基因片段CCP1,CCP2和SP(serineproteasedomain)为研究对象,完成了三种腺病毒载体的构建。目的：①在大肠埃希菌BL21(DE3)中对pGEM-T-CCP1-CCP2-SP,pGEM-T-CCP2-SP和pGEM-T-SP进行表达纯化,获得CCP1-CCP2-SP、CCP2-SP和SP三种目的蛋白。②分别构建pYr-adshuttle-1-CCP1-CCP2-SP,pYr-adshuttle-1-CCP2-SP和pYr-adshuttle-1-SP三种腺病毒穿梭载体,并将其与腺病毒骨架载体pAd/PL-DEST进行同源重组,为下一步腺病毒包装和MASP-2活性片段结构和功能的研究奠定基础,为进一步研究其对感染发生发展的影响做准备。方法：①将pGEM-T-CCP1-CCP2-SP,pGEM-T-CCP2-SP和pGEM-T-SP质粒转化入表达菌BL21(DE3)中,以37℃、3h和IPTG终浓度0.75mM的最佳诱导条件使目的蛋白表达于上清。对菌液分别进行收集,以超声破碎菌体和离心的方法获得上清中的CCP1-CCP2-SP(43.89KDa),CCP2-SP(36.89KDa)和SP(27.22KDa)三种目的蛋白,并用Ni离子柱对其进行纯化。②以pGEM-T-CCP1-CCP2-SP为模板,用PCR方法扩增CCP1-CCP2-SP(1185bp),CCP2-SP(996bp)和SP(735bp)三种基因序列,并与腺病毒穿梭质粒pYr-adshuttle-1(4470bp)分别经BamHI和EcoRI双酶切后相互连接,构建成三种重组腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle-l-CCP1-CCP2-SP,pYr-adshuttle-1-CCP2-SP以及pYr-adshuttle-1-SP。大量扩增重组质粒后,将其分别与腺病毒骨架载体pAd/PL-DEST进行同源重组。结果：①成功表达了CCP1-CCP2-SP,CCP2-SP和SP三种目的蛋白,经SDS-PAGE蛋白电泳验证分别在44KDa,37KDa和27KDa附近出现与预测值一致的目的条带。②构建了pYr-adshuttle-1-CCP1-CCP2-SP,pYr-adshuttle-1-CCP2-SP和pYr-adshuttle-1-SP三种腺病毒穿梭载体,经PCR验证分别在800bp,1000bp和1200bp附近出现目的条带。测序结果与GenBank里的基因序列进行比对,证实基因序列和NCBI数据库中的基因序列100%匹配且无基因突变。结论：成功表达了三种目的蛋白,但蛋白降解使得即使在表达后半小时内就进行纯化,也未能得到纯化了的CCP1-CCP2-SP,CCP2-SP和SP。为了研究固有免疫分子MASP-2活性片段的结构和功能,研究其对感染发生发展的影响,最终又成功构建了pYr-adshuttle-1-CCP1-CCP2-SP,pYr-adshuttle-1-CCP2-SP和pYr-adshuttle-1-SP三种腺病毒穿梭载体,为之后的腺病毒骨架载体质粒同源重组和腺病毒包装奠定了基础。
【作者】王倩；
【导师】马兴铭；
【作者基本信息】兰州大学，免疫学，2014，硕士
【关键词】MASP-2；蛋白表达；重组腺病毒载体；

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